Исследование системы гемостаза в клинико-диагностической лаборатории

Первичный гемостаз начинается с повреждения эндотелия. Фактор фон Виллебранда (VWF), вырабатываемый эндотелиальными клетками, связывается с тромбоцитами и соединяет их с субэндотелиальным коллагеном. АДФ и тромбоксан, высвобождаемые тромбоцитами, активируют неприсоединившиеся тромбоциты через рецепторы GPIIb/IIIa, благодаря чему эти тромбоциты участвуют в агрегации.

Вторичный гемостаз начинается со связывания фактора VII с внесосудистым тканевым фактором (TF). Факторы II, VII, IX и X относятся к витамин-K-зависимым факторам. Витамин K участвует в присоединении гамма-карбоксильных групп к остаткам глутаминовой кислоты в GLA-доменах этих факторов.

В условиях in vitro внутренний путь активируется, когда свежую цельную кровь помещают в стеклянную пробирку. Отрицательный заряд стекла запускает контактный путь: активируется фактор XII, после чего фактор XIa расщепляет фактор IX с образованием фактора IXa. Внешний путь запускается добавлением тканевого фактора, фосфолипидов и кальция к плазме, антикоагулированной цитратом. В условиях in vitro фактор VII активируется до фактора VIIa, а комплекс TF–VIIa преимущественно превращает фактор X в фактор Xa, активируя общий путь.

Протромбиновое время обычно используют для контроля антикоагулянтной терапии варфарином. Для коррекции различий между реагентами и приборами был разработан международный нормализованный показатель, позволивший повысить стандартизацию представления результатов протромбинового времени во всем мире. Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) используют для оценки внутреннего и общего путей свертывания. АЧТВ применяется в клинической практике как скрининговый тест при наследственном и приобретенном дефиците факторов, а также для контроля терапии нефракционированным гепарином, хотя в настоящее время предпочтительным методом оценки действия нефракционированного гепарина считается определение анти-Xa-активности. Исследование фибриногена по методу Клаусса выполняют чаще всего; оно основано на использовании разведенной плазмы, в которой свертывание инициируют высокой концентрацией тромбина в реагенте.

Тест смешивания помогает оценить патологическое удлинение протромбинового времени или АЧТВ. Равные объемы цитратной плазмы пациента и нормальной объединенной плазмы смешивают, после чего повторно определяют протромбиновое время или АЧТВ в смеси в соотношении 1:1. Активность факторов чаще всего определяют одностадийным методом. Цитратную плазму пациента разводят и смешивают в соотношении 1:1 с субстратной плазмой, дефицитной по одному конкретному фактору. В полученной смеси определяют протромбиновое время или АЧТВ в зависимости от исследуемого фактора.

Ингибиторы факторов представляют собой антитела, которые чаще всего выявляют у мужчин с тяжелой гемофилией A (дефицитом фактора VIII), где они образуются в ответ на заместительную терапию фактором. Ингибиторы факторов также могут возникать в виде спонтанных аутоантител у ранее здоровых мужчин и женщин. Это аутоиммунное состояние называется приобретенной гемофилией.

В большинстве лабораторий, выполняющих исследования свертывания, концентрацию белка VWF в плазме (антиген VWF) можно определить иммунотурбидиметрическим методом. Для оценки функциональной активности VWF используют препарат ристоцетин. Степень мультимеризации VWF имеет большое значение и оценивается с помощью электрофореза в агарозном геле. Для болезни фон Виллебранда типов 2A и 2B характерно отсутствие мультимеров промежуточной и высокой молекулярной массы.

Антифосфолипидный синдром (АФС) представляет собой приобретенное аутоиммунное состояние, связанное с повышенной частотой венозных и артериальных тромбозов, а также потерь беременности. Как правило, при этом парадоксально удлиняется АЧТВ, несмотря на отсутствие каких-либо клинических признаков кровотечения. Это так называемый эффект волчаночного антикоагулянта. Лабораторное определение АФС требует выявления либо волчаночного антикоагулянта, либо стойко сохраняющегося титра антифосфолипидных антител.

В настоящее время существуют два основных класса прямых пероральных антикоагулянтов: 1) прямые ингибиторы тромбина для приема внутрь, например дабигатран; 2) прямые ингибиторы фактора Xa для приема внутрь, например ривароксабан и апиксабан. Прямые пероральные антикоагулянты оказывают различное влияние на протромбиновое время и АЧТВ, поэтому эти показатели обычно не позволяют оценить их концентрацию. Самое важное: нормальные значения протромбинового времени или АЧТВ НЕ исключают наличия любого из прямых пероральных антикоагулянтов.