Гетерологичная экспрессия наттокиназы в E. coli: биохимическая характеристика и функциональный анализ аминокислотных остатков, связывающих фибрин

Гетерологичную экспрессию наттокиназы — мощного фибринолитического фермента — успешно осуществляли в различных микроорганизмах. Однако получить этот фермент в E. coli в виде растворимого белка ранее не удавалось. В настоящем исследовании изучали экспрессию наттокиназы в E. coli в растворимой форме, а затем охарактеризовали её биохимические свойства и фибринолитическую активность. Культивирование штамма E. coli BL21C с вектором pET32a и белковым шапероном pGro7 при индукции IPTG (16 °C, 180 об/мин, 16 ч) позволило получить рекомбинантную наттокиназу в растворимой фракции. Ферментативные анализы подтвердили протеазную активность фермента. Оптимальные условия катализа — 37 °C и pH 8,0; фермент сохранял высокую стабильность в широком диапазоне pH (6,0–10,0) и при температуре до 50 °C. Кинетические константы составили: Km = 25,83 ± 3,43 мкМ, Vmax = 62,91 ± 1,68 мкМ/с, kcat = 38,45 ± 1,06 с и kcat/Km = 1,49 × 10 M s. Фибринолитическая активность наттокиназы, определённая методом гидролиза фибрина на фибриновой пластине, составила 1038 ± 156 Ед/мл, а удельная активность — 1730 ± 260 Ед/мг. Время лизиса искусственного сгустка массой 1 мг составило 51,5 ± 2,5 мин, что свидетельствует о фибринолитическом потенциале наттокиназы. При молекулярном докинге энергия связывания наттокиназы с фибрином составила −6,46 ккал/моль, что указывает на высокое сродство. Были выявлены и подтверждены ключевые аминокислотные остатки фибрина, связывающие фермент: Ser300, Leu302 и Asp303. Мутации этих остатков влияли именно на связывание фибрина, но не на протеолитическую активность наттокиназы. Исследование определяет условия получения растворимой наттокиназы в E. coli и характеризует её биохимические свойства, создавая основу для дальнейших исследований и потенциального применения в медицине и биотехнологии.