Высокоэффективная жидкостная хроматография в фармацевтическом анализе

При проведении предпусковой процедуры допуска лекарственных средств и их контроля в последние десять лет высокоэффективная жидкостная хроматография вытеснила множество спектроскопических методов и газовую хроматографию из количественного и качественного анализа. На раннем этапе применения высокоэффективной жидкостной хроматографии считалось, что она станет лишь дополнением к газовой хроматографии, однако сегодня в фармацевтическом анализе она почти полностью ее заменила. Использование жидкой подвижной фазы с возможностью изменения ее полярности в ходе хроматографии и других модификаций подвижной фазы в зависимости от свойств исследуемого вещества дает существенное преимущество в процессе разделения по сравнению с другими методами. Следующий фактор, обеспечивающий хорошее разделение, — более широкий выбор неподвижной фазы. Линия разделения связана со специфичными и чувствительными системами детектирования — спектрофлуориметром, диодным детектором, электрохимическим детектором, а также другими сопряженными системами HPLC-MS и HPLC-NMR; именно на этих элементах основано столь широкое и эффективное применение метода HPLC. Цель анализа любых лекарственных препаратов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) — подтвердить идентичность препарата, получить количественные результаты, а также контролировать ход терапии заболевания. На рис. 1 показана хроматограмма плазмы пациентов с депрессией за 12 ч до перорального введения дексаметазона. Метод может также использоваться для углубления понимания нормальных и патологических процессов в организме человека в ходе биомедицинских и терапевтических исследований до регистрации лекарственных средств. Анализ лекарств и метаболитов в биологических жидкостях, особенно в плазме, сыворотке или моче, — одно из наиболее сложных и вместе с тем наиболее распространенных применений высокоэффективной жидкостной хроматографии. Кровь, плазма или сыворотка содержат множество эндогенных соединений, часто присутствующих в концентрациях значительно выше, чем у аналита. Концентрации аналитов нередко низкие, а в случае лекарств эндогенные соединения иногда структурно очень похожи на измеряемый препарат. Кроме того, возможно связывание лекарств с белками плазмы, что уменьшает количество свободного соединения, подлежащего измерению. Для анализа лекарств и метаболитов в жидкостях организма аналитик сталкивается с несколькими проблемами. Первая связана со сложной природой биологической жидкости: лекарства необходимо выделять методом экстракции, который в идеале должен давать относительно чистый экстракт, а система разделения должна обеспечивать отделение интересующих лекарств от соэкстрагируемых веществ. Все перечисленное при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии требует правильного выбора детекторов, неподвижной фазы, элюентов и адекватной программы разделения. УФ-детектор — наиболее универсальный детектор, используемый в высокоэффективной жидкостной хроматографии, однако он не всегда является оптимальным, поскольку его неспецифичность может потребовать высокого разрешения аналита. УФ-детектирование предпочтительно, так как обеспечивает отличную линейность, а быстрые количественные анализы можно проводить по одному стандарту определяемого препарата. Диодно-матричные и быстросканирующие детекторы полезны для идентификации пиков и контроля их чистоты, но они несколько менее чувствительны, чем одноволновые детекторы. В жидкостной хроматографии некоторые компоненты могут иметь слабые УФ-хромофоры при использовании УФ-детектирования или полностью удерживаться на хроматографической колонке. Флуоресцентный и электрохимический детекторы не только значительно более чувствительны к соответствующим аналиту соединениям, но и более селективны, чем УФ-детекторы, для многих веществ. По возможности флуоресцентные детекторы чувствительны, стабильны, селективны и просты в работе. Их селективность проявляется в отсутствии фронтальных компонентов, наблюдаемых в экстракте плазмы, тогда как при электрохимическом детектировании почти всегда отмечается выраженный фронтальный пик со значительным хвостом. Наиболее чувствительным методом на сегодняшний день является восстановительное электрохимическое детектирование, дающее отличные результаты при исследовании некоторых классов лекарственных средств. Разработан ряд окислительных электрохимических методов высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа лекарств и метаболитов в биологических жидкостях. Также используют масс-спектрометр как специфичный детектор со всеми вариантами ионизации и интерфейсов (thermo spray, moving belt и др.) или жидкостную хроматографию в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. В настоящее время в высокоэффективной жидкостной хроматографии применяют и ЯМР как селективный и специфичный детектор. Разработка неводного элюента для ионообменного разделения на силикагеле обеспечила отличную систему, которая в сочетании с электрохимическим детектором позволяет анализировать широкий спектр, особенно основных, лекарственных средств и метаболитов. Новые сорбенты, такие как полимерные материалы, деактивированный по основанию силикагель, пиролизованный углерод и сорбенты с модификацией внутренней поверхности, должны обеспечить лучшую стабильность и более высокую эффективность для некоторых классов соединений, таких как основные лекарственные средства. Колонки с микродиаметром должны получать более широкое признание, поскольку они обеспечивают не только лучшую чувствительность, но и меньшее потребление растворителя и, следовательно, меньшую потребность в утилизации токсичных растворителей. Многие анализы основных лекарственных средств по-прежнему выполняют тем же методом ионообменной хроматографии на немодифицированных силикагелевых колонках с элюентом, буферированным примерно до pH 9. Нейтральные или слабокислые препараты, например барбитураты, можно хроматографировать в обращенно-фазовой системе, тогда как кислые препараты, например парацетамол и каннабис, разделяют либо методом подавления ионизации, либо ион-парной хроматографией на обращенно-фазовом сорбенте. В мицеллярной жидкостной хроматографии вместо обычной гидроорганической подвижной фазы в обращенно-фазовой системе используют мицеллярные подвижные фазы. В мицеллярной жидкостной хроматографии между веществом, неподвижной и подвижной фазами существуют сложные электростатические, гидрофобные и стерические взаимодействия. Это обеспечивает эффективное разделение образцов различной природы. Основные преимущества использования мицеллярного раствора в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии — экономия растворителя, более низкая стоимость и токсичность, биодеградация растворителя и легкое растворение аналитических образцов, что позволяет определять лекарства в физиологических жидкостях без предварительного отделения содержащихся в них белков. При исследовании сульфаниламидов в качестве конкурирующего основания используют тетрабутиламмония фосфат, а в качестве ион-парного реагента — гептансульфонат. Ион-парный реагент — это термин, используемый для обозначения усиленного удерживания в результате добавления в подвижную фазу крупного иона с зарядом, противоположным заряду молекулярных ионов, которые необходимо разделить. Для молекулярных катионов обычно используют алкилсульфаты или сульфонаты.