Новый метод in vitro для идентификации химических сенсибилизаторов, сочетающий связывание пептидов с экспрессией генов, опосредованной ARE/EpRE, в клетках кожи человека

Аллергический контактный дерматит (АКД) представляет собой существенную проблему безопасности для разработчиков косметической, уходовой, химической, фармацевтической продукции и медицинских изделий. Тест максимизации на морских свинках (GMPT) и местный лимфатический узловой тест на мышах (LLNA) являются общепринятыми методами определения химической сенсибилизации. Недавние законодательные инициативы в Европе требуют разработки новых альтернативных in vitro-методов, заменяющих эксперименты на животных для оценки химической сенсибилизации. Целью проекта была разработка скринингового in vitro-метода, использующего линию клеток кожи человека HaCaT, химическую реактивность и профили экспрессии генов для выявления положительных и отрицательных ответов, отнесения веществ к категориям силы сенсибилизирующего действия: экстремально сильные/сильные (ES), умеренные (M), слабые (W) и несенсибилизирующие (N), а также для получения оценки соответствующих значений LLNA. Метод и алгоритм обработки были разработаны на обучающей выборке из 39 веществ с широким диапазоном сенсибилизирующей активности. В этой модели также оценивали три катионных металла: хром (Cr), никель (Ni) и серебро (Ag). Химическую реактивность определяли по истощению глутатиона (GSH) в бесклеточной матрице. Контролировали три сигнальных пути (Keap1/Nrf2/ARE/EpRE, ARNT/AhR/XRE и Nrf1/MTF/MRE), которые, как известно, активируются сенсибилизирующими агентами, путем измерения относительной экспрессии 11 генов, регулируемых одним из этих трех путей. Конечные концентрации экспозиции определяли с учетом токсичности и растворимости. Для каждого соединения проводили предварительный эксперимент для оценки цитотоксичности и растворимости. В финальных экспериментах использовали шесть концентраций экспозиции (от 0,1 до 2500 мкМ) и время экспозиции 24 часа. Только по истощению глутатиона нельзя было достичь точности, необходимой для различения категорий силы действия. Однако сочетание химической реактивности с профилями экспрессии генов значительно улучшило прогнозы in vitro. Для каждого исследуемого вещества рассчитывали предсказанный индекс токсичности (PTI). Сопоставление значений LLNA и PTI выявило обратную зависимость. Большая вариабельность данных LLNA для соединений, относящихся к одной категории силы действия, затрудняет прямую экстраполяцию PTI на LLNA. Для проверки системы 58 дополнительных соединений были представлены в слепом режиме. Соединения, отнесенные к категориям ES и M, считали положительными, тогда как соединения категорий W и N — отрицательными. Точность составила примерно 84%, чувствительность — 81%, специфичность — 92%. Модель правильно идентифицировала 2 из 3 катионных металлов как положительные. Таким образом, описанный метод представляет собой ценную in vitro-платформу для идентификации химических веществ и металлов, вызывающих кожную сенсибилизацию.