Повышение кислотоустойчивости, каталитической эффективности и термостабильности наттокиназы с помощью многосайтового направленного мутагенеза

Наттокиназа (NK) — сериновая протеаза семейства субтилизинов; как мощный фибринолитический фермент, она потенциально может применяться для лечения тромбозов. Для использования NK в качестве перорального препарата при сердечно-сосудистых заболеваниях необходимо обеспечить её устойчивость к крайне кислой среде желудочно-кишечного тракта, поскольку исходный фермент обладает ограниченной кислотоустойчивостью. В этом исследовании для повышения кислотоустойчивости NK применили три стратегии: (а) конструирование поверхностного заряда, (б) выравнивание последовательностей и (в) мутагенез на основе данных литературы. Были созданы 11 вариантов, среди которых отобрали четыре точечные мутации с выраженными каталитическими свойствами: Q59E повышала удельную активность; S78T улучшала устойчивость к кислоте; Y217K повышала устойчивость к кислоте и нагреванию; N218D улучшала термостабильность. На основании этих результатов были созданы и охарактеризованы варианты с мутациями в нескольких участках; один из них обладал повышенными кислотоустойчивостью, каталитической эффективностью и термостабильностью. Для выяснения молекулярного механизма повышения устойчивости мутантов S78T и Y217K в кислой среде провели молекулярно-динамическое моделирование. В исследовании изучены эффективные стратегии повышения кислотоустойчивости NK; кроме того, выявленные варианты NK с улучшенными каталитическими свойствами потенциально могут применяться в медицинской промышленности.