Комбинированные компьютерные предикторы для повышения термостабильности наттокиназы

Наттокиназа пищевого происхождения обладает выраженной тромболитической активностью и вызывает мало побочных эффектов. В медицине наттокиназу разрабатывают как вспомогательное лекарственное средство для лечения тромбозов; напитки и продукты для здоровья, обогащённые наттокиназой, также имеют большой потенциал для применения в пищевой промышленности. В настоящее время низкая термостабильность наттокиназы ограничивает её промышленное производство и применение. В этом исследовании с помощью нескольких алгоритмов прогнозирования термостабильности была изучена наттокиназа AprY из LY-06, а также отобраны два варианта — S33T и T174V — с повышенной термостабильностью и фибринолитической активностью. Период полураспада t1/2 вариантов S33T и T174V был соответственно в 8,87 и 2,51 раза больше, чем у дикого типа AprY; их ферментативная активность также повысилась — соответственно в 1,17 и 1,28 раза. Хотя термостабильность N218L увеличилась в 2,7 раза, его фибринолитическая активность составила лишь 73,3% от активности дикого типа AprY. Результаты исследований многоточечных мутаций показали, что варианты S33T-N218L и S33T-T174V-N218L утратили активность, а вариант T174V-N218L не продемонстрировал значимых изменений каталитических свойств. При этом вариант S33T-T174V повысил термостабильность и активность соответственно на 21,3 и 24,8%. Хотя для варианта S33T-T174V аддитивного эффекта в отношении термостабильности не наблюдалось, он сочетал выраженную кратковременную термостабильность S33T с более высокой тромболитической активностью T174V. Биоинформатический анализ показал, что общая структура вариантов S33T и T174V была более стабильной, тогда как структура варианта S33T-T174V отличалась большей гибкостью. Анализ локальной структуры показал, что повышение жёсткости области активного центра (положения 64–75) и ключевых петель (положения 129–130, 155–163, 187–192, 237–241 и 268–270) определяло повышение термостабильности всех вариантов. Кроме того, повышенная гибкость варианта S33T-T174V в области связывания Ca1 (положения 1–4 и 75–82) и периферической области каталитического кармана (положения 210–216) может объяснять отсутствие аддитивного повышения его термостабильности. В исследовании была определена эффективная стратегия повышения термостабильности наттокиназы; полученные варианты обладают потенциалом для промышленного производства и применения. Bacillus mojavensis1/2