Оценка активной трансляции в ооцитах, входящих в состав кумулюс-ооцитарных комплексов, и денудированных ооцитах при стандартном созревании in vitro и на ранних этапах развития эмбриона

Вопрос исследования: Какие материнские транскрипты, активно участвующие в трансляции, регулируются по-разному при клинически значимых условиях созревания in vitro и in vivo ооцитов и зигот мыши?

Краткий ответ: Выявлены значимые различия в транскриптоме в целом, а также изменения трансляции отдельных транскриптов, кодирующих компоненты энергетического обмена, регуляторы клеточного цикла и белкового синтеза в ооцитах, а также участвующих в метаболизме РНК в зиготах.

Что известно: Правильная регуляция трансляции запасённых материнских транскриптов имеет решающее значение для успешного развития ооцитов и ранних эмбрионов, особенно в связи с транскрипционно неактивной фазой мейоза.

Дизайн исследования, размер выборки, продолжительность: Это фундаментальное исследование на модели мышей линии ICR, наиболее подходящей для изучения созревания in vivo. В группе лечения полностью выросшие ооциты на стадии герминативного пузырька, полученные из стимулированных яичников, созревали in vitro до стадии метафазы II (MII) либо в денудированном состоянии без гонадотропинов (IVM DO), либо в составе кумулюс-ооцитарных комплексов (IVM COC) в присутствии 0,075 МЕ/мл рекомбинантного ФСГ (rFSH) и 0,075 МЕ/мл рекомбинантного ХГЧ (rhCG). Для учёта изменений потенциала развития в исследование включали также кумулюс-ооцитарные комплексы, созревающие in vitro, из нестимулированных яичников (IVM COC−). Контролем служили ооциты MII, созревшие in vivo (IVO) в стимулированных яичниках после индукции овуляции с помощью rhCG. Для моделирования стандартных условий созревания in vitro в культуральные среды добавляли аминокислоты, витамины и бычий сывороточный альбумин. Соответственно, зиготы с пронуклеусами, развившиеся in vitro (IMZ), получали методом экстракорпорального оплодотворения из ооцитов IVM DO и сравнивали с зиготами с пронуклеусами, развившимися in vivo (IVZ). Все эксперименты выполняли в четырёх повторностях; образцы собирали для фракционирования полирибосом и анализа транскриптома в целом. Образцы получали в течение трёх последовательных месяцев.

Участники/материалы, условия проведения, методы: Все мыши линии ICR содержались и разводились в соответствии с разрешением на проведение экспериментов на животных (№ MZE-24154/2021-18134), выданным Министерством сельского хозяйства Чешской Республики. Материнские транскрипты, активно участвующие в трансляции (ассоциированные с полирибосомами), выявляли в ооцитах и зиготах мыши, созревших in vitro и in vivo, с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности с последующим выделением РНК и высокопроизводительным секвенированием РНК. Выполняли биоинформатический анализ, а затем подтверждали полученные данные методом вестерн-блоттинга, радиоизотопного мечения и окрашивания красителем MitoTracker.

Основные результаты и роль случайности: Анализ экспрессии генов по данным высокопроизводительного секвенирования РНК, выделенной из полисомных фракций, выявил значимые различия в трансляции между ооцитами, созревшими in vitro и in vivo, а также между полученными из них зиготами с пронуклеусами (RPKM ≥ 0,2; P ≤ 0,005). Неожиданно при сравнении данных секвенирования РНК из фракционированного и общего транскриптома в группах IVM DO и IVM COC обнаружили лишь очень небольшое число транскриптов, различавшихся более чем в 2 раза. Радиоизотопное мечение подтвердило снижение глобальной трансляции на 20% в образцах IVM DO и IVM COC по сравнению с образцами IVO. Кроме того, условия созревания in vitro нарушали энергетический обмен ооцитов, что подтверждалось изменениями рекрутирования в полисомы каждого из 13 транскриптов, кодирующих митохондриальные белки, а также результатами окрашивания MitoTracker Red.

Данные широкомасштабного анализа: Данные, представленные в этой публикации, размещены в базе данных NCBI Gene Expression Omnibus и доступны по номеру серии GEO GSE241633 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE241633).

Ограничения и основания для осторожности: В модельных системах на животных, например на свиньях или крупном рогатом скоте, крайне сложно обеспечить воспроизводимость созревания in vivo. Для достижения высокой воспроизводимости стимуляции in vivo была выбрана модель мышей линии ICR. Однако при интерпретации полученных результатов применительно к методам вспомогательных репродуктивных технологий необходимо учитывать межвидовые различия между мышами и человеком. Кроме того, изолированный вклад клеток кумулюса невозможно было адекватно оценить при сравнении групп IVM COC и IVM DO, поскольку ооциты IVM DO созревали без добавления гонадотропинов.

Более широкие последствия результатов: Полученные данные подтвердили меньшую эффективность стандартной технологии созревания in vitro по сравнению с созреванием in vivo. Они также указывают на нарушение биологических процессов, участвующих в критически важной регуляции трансляции в ооцитах MII и зиготах с пронуклеусами, созревших in vitro. Подчёркивая значение правильной регуляции трансляции при созревании ооцитов in vitro, это исследование должно стимулировать дальнейшие клинические исследования в данной области.

Финансирование исследования и конфликт интересов: Работа выполнена при поддержке Чешского научного фонда (22-27301S), Грантового агентства Карлова университета (372621), Министерства образования, молодёжи и спорта (EXCELLENCE CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000460 OP RDE) и институциональной исследовательской программы RVO67985904. Конфликт интересов не заявлен.