Ультрабыстрая и традиционная витрификация ооцитов: сравнительное исследование клинических и молекулярных исходов с данными одно-клеточной транскриптомики

Вопрос исследования: Если сократить длительность процедуры витрификации-оттаивания до 1 мин, позволяет ли ультрабыстрая витрификация-оттаивание (УВВ/О) эффективно сохранять жизнеспособность ооцитов и улучшать клинические исходы по сравнению с традиционным временем витрификации-оттаивания (ТВ/О; 14 мин), и каковы эффекты обеих процедур на клеточный стресс?

Краткий ответ: УВВ/О сокращает время процедуры, уменьшает экспозицию к криопротекторам, повышает выживаемость ооцитов и сопровождается меньшим числом транскриптомных изменений в ооцитах, чем ТВ/О.

Что уже известно: Методы ТВ/О требуют длительного воздействия криопротекторов и микроманипуляций, что повышает клеточный стресс и риск криоповреждения. Процедуры УВВ/О решают эти проблемы за счет сокращения экспозиции и манипуляций, однако сравнительные данные по клиническим исходам и транскриптомным профилям в человеческих ооцитах остаются ограниченными.

Дизайн исследования, объем, длительность: Исследование проводили с августа 2024 по декабрь 2024 года; оно включало клиническую и транскриптомную когорты для всесторонней оценки влияния метода криоконсервации на жизнеспособность ооцитов и эмбрионов, их развитие и клеточный стресс. Клиническая когорта включала 1077 ооцитов для оценки клинических исходов при ТВ/О и УВВ/О. Кроме того, в проспективный транскриптомный анализ включили 68 ооцитов от 4 доноров. Ооциты и образцы трофэктодермы бластоцист распределяли по трем группам: свежие, ТВ/О и УВВ/О.

Участники/материалы, условия, методы: Клиническое исследование выполнили на 1077 ооцитах от 46 доноров, сопоставленных и распределенных для сравнения клинических исходов при ТВ/О (n = 519) и УВВ/О (n = 558). После витрификации-оттаивания ооциты оплодотворяли методом ИКСИ для оценки развития эмбрионов и клинических исходов. В транскриптомной когорте проводили транскриптомное тестирование и анализ в рамках проспективного исследования для сравнения ТВ/О и УВВ/О по эффективности замораживания и оттаивания ооцитов, их влиянию на развитие эмбрионов и молекулярным эффектам. Всего получили 68 образцов от 4 доноров, включая по восемь ооцитов и восемь биопсий трофэктодермы из каждой из трех групп. Эти образцы анализировали для изучения клеточных эффектов стресса, индуцированного криоконсервацией, с помощью транскриптомного профилирования. Одноклеточное транскриптомное исследование включало подготовку библиотек кДНК с последующим секвенированием нового поколения для изучения дифференциальной экспрессии генов в ооцитах и клетках трофэктодермы эмбрионов в трех группах. Этот метод позволил всесторонне отслеживать транскрипционную активность, выявлять и количественно оценивать молекулы мРНК и оценивать транскриптомные сигнатуры исследуемых групп. Кроме того, выполняли функциональное обогащение генов с повышенной и пониженной экспрессией с их классификацией по онтологии генов для выявления потенциальных путей, связанных с качеством эмбриона и клеточным стрессом.

Основные результаты и роль случайности: Транскриптомный анализ показал, что паттерны экспрессии генов после УВВ/О были ближе к свежим ооцитам, чем после ТВ/О. Различия в паттернах экспрессии генов между бластоцистами трех групп были минимальными, поскольку общее число дифференциально экспрессируемых генов было ограниченным. Ооциты, подвергнутые УВВ/О, имели достоверно более высокую выживаемость, меньшую дегенерацию после ИКСИ и давали больше бластоцист хорошего качества на 5-е сутки по сравнению с ооцитами, витрифицированными методом ТВ/О (для всех сравнений P < 0,001). Маловероятно, что эти результаты можно объяснить только различиями во времени процедуры, поскольку частота оплодотворения, дробления, эуплоидии, клинической беременности и живорождения между группами не различалась (для всех сравнений P > 0,05).

Ограничения, причины для осторожности: Все донорские ооциты (1145), переданные для исследовательских целей, включали в исследование без отбора по качеству. В транскриптомный анализ включали только эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты на 5-е или 6-е сутки при использовании метода УВВ/О. Эмбрионы, не достигшие этих стадий, исключали. Следовательно, анализировали и сравнивали между тремя группами только данные эмбрионов с оптимальным развитием и хорошим качеством. Получение кДНК в одноклеточных исследованиях — новый и сложный процесс, особенно из-за ограниченного количества РНК. Хотя можно проводить расширенные клинические оценки биопсированных ооцитов и эмбрионов, неудача в получении кДНК из тех же образцов может приводить к неполным данным, что ограничивает общий объем и результаты исследования.

Более широкое значение результатов: Полученные расширенные одноклеточные транскриптомные данные помогут определить пути, изменяющиеся при разных методах витрификации, и дадут важные представления об их эффективности и потенциальных рисках в клинической практике. Кроме того, результаты позволят выделить ключевые гены и пути, участвующие в эмбриональном стрессе, что даст возможность разработать более экономичные, целевые генные панели для оценки этих факторов.

Финансирование исследования/конфликт интересов: Исследование финансировалось за счет собственных средств Sanatórium pre liečbu neplodnosti SPLN, Ovogene и Mikrogen Genetic Diagnosis Laboratory. A.V.P. является Medical Science Liaison в Kitazato Corporation-Dibimed. Его роль в исследовании была строго научной и не связана с коммерческими интересами. Все остальные авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Номер регистрации исследования: н/п.