Регуляция и сигнальные механизмы действия антимюллерова гормона в клетках гранулезы человека: значение для синдрома поликистозных яичников

Вопрос исследования: Что препятствует снижению уровня антимюллерова гормона (АМГ) при синдроме поликистозных яичников (СПКЯ) и каковы последствия этого для развития фолликулов в таких яичниках?

Краткий ответ: Воздействие на клетки гранулезы высоких концентраций андрогенов, соответствующих уровням при СПКЯ, предотвращало снижение уровня АМГ и сопровождалось нарушением передачи сигнала АМГ через SMAD, что приводило к задержке развития фолликулов при СПКЯ.

Что уже известно: В нормальных яичниках АМГ оказывает ингибирующее влияние на развитие антральных фолликулов, а снижение его уровня необходимо для овуляции. При СПКЯ концентрация АМГ повышена, что способствует нарушению роста фолликулов — одной из распространённых причин ановуляторного бесплодия у таких женщин.

Дизайн исследования, размер выборки, продолжительность: Клетки KGN-GC — клеточная линия, соответствующая незрелым клеткам гранулезы мелких антральных фолликулов, — культивировали с различными дозами разных андрогенов для определения их влияния на продукцию АМГ. Для изучения связи между экспрессией АМГ и соотношением ERα:ERβ клетки KGN-GC также обрабатывали PHTPP — антагонистом β-рецептора эстрогенов (ERβ). В лютеинизированных клетках гранулезы человека (hGLC), полученных от женщин с нормальными яичниками, поликистозной морфологией яичников (PCOM) и СПКЯ, изучали зависимое от дозы влияние АМГ на экспрессию генов и передачу сигнала через SMAD. Для оценки влияния АМГ на пролиферацию и жизнеспособность клеток клетки KGN-GC длительно культивировали с различными дозами гормона.

Участники, материалы, условия и методы: Продукцию белка АМГ клетками, подвергавшимися воздействию андрогенов, измеряли методом ИФА. Влияние PHTPP на уровни экспрессии мРНК АМГ, ERα и ERβ оценивали методом количественной ПЦР в реальном времени (qPCR). В контрольных hGLC, а также в hGLC при PCOM и СПКЯ методом qPCR количественно определяли влияние АМГ на относительные уровни экспрессии мРНК ароматазы, АМГ и его рецептора AMHRII, а также рецепторов ФСГ и ЛГ (FSHR и LHR). Методом вестерн-блоттинга оценивали изменения уровней белков SMAD (pSMAD-1/5/8, SMAD-4, SMAD-6 и SMAD-7) после воздействия АМГ на hGLC здоровых женщин и женщин с СПКЯ. Для оценки влияния АМГ на жизнеспособность и цитотоксичность клеток, а также апоптоз использовали тест ApoTox-Glo Triplex.

Основные результаты и роль случайности: Тестостерон снижал количество белка АМГ, секретируемого клетками KGN-GC, при концентрациях 10⁻⁹–10⁻⁷ М (P < 0,05; P < 0,005; множественные нескорректированные сравнения, критерий наименьшей значимой разности Фишера), однако при концентрациях, соответствующих гиперандрогенемии, изменений уровня АМГ не выявили. 5α-ДГТ вызывал достоверное дозозависимое увеличение количества белка АМГ, секретируемого в культуральную среду (P = 0,022; однофакторный дисперсионный анализ). Увеличение соотношения мРНК ERα:ERβ сопровождалось соответствующим повышением экспрессии мРНК АМГ (P = 0,015; двухфакторный дисперсионный анализ). АМГ повышал уровни мРНК ароматазы (P < 0,05; однофакторный дисперсионный анализ) и FSHR (P < 0,0001; однофакторный дисперсионный анализ) в hGLC женщин с PCOM, но не в клетках женщин с нормальными яичниками или СПКЯ (нормальные яичники, n = 7; PCOM, n = 5; СПКЯ, n = 4). В отличие от hGLC из овулирующих яичников, в клетках при СПКЯ АМГ снижал внутриклеточное содержание стимулирующих белков pSMAD-1/5/8 и SMAD-4, но повышал содержание ингибирующих белков SMAD-6 и SMAD-7 (P < 0,05; нормальные яичники, n = 6; СПКЯ, n = 3). АМГ в концентрациях 20 и 50 нг/мл снижал пролиферацию клеток KGN-GC, но не их жизнеспособность после 8 дней лечения (P < 0,005; двухфакторный дисперсионный анализ).

Данные крупномасштабного исследования: Не применимо.

Ограничения и причины для осторожной интерпретации: Лютеинизированные клетки гранулезы женщин, проходящих экстракорпоральное оплодотворение, характеризуются относительно низкой экспрессией АМГ и AMHRII, однако сохраняют реакции, свойственные морфологическому типу яичников, из которых они были получены. Поэтому дополнительно использовали клеточную линию KGN, для которой показано соответствие стадии развития, близкой к стадии незрелых клеток гранулезы. Отсутствие влияния флутамида на эффекты тестостерона само по себе не позволяет утверждать, что влияние на АМГ опосредовано превращением тестостерона в эстроген; необходимо изучить действие ингибиторов ароматазы или специфических ингибиторов эстрогенов. Влияние флутамида исследовали для тестостерона, но не для ДГТ.

Более широкие последствия результатов: Нормальные фолликулогенез и овуляция зависят от своевременного снижения продукции АМГ клетками гранулезы в момент отбора фолликула. Наши результаты впервые показывают, что андрогены тека-клеточного происхождения могут участвовать в этом процессе, однако их ингибирующее действие утрачивается при концентрациях, соответствующих уровням при СПКЯ. Снижение уровня АМГ может быть прямым эффектом андрогенов либо опосредоваться их превращением в эстрадиол с последующим повышением экспрессии ERα, который, как известно, стимулирует промотор АМГ. Примечательно, что способность клеток гранулезы реагировать на постоянно повышенный уровень АМГ, по-видимому, снижена у женщин с СПКЯ вследствие адаптивного изменения сигнального пути SMAD и более низкой экспрессии AMHRII, что указывает на форму «резистентности к АМГ».

Финансирование исследования и конфликт интересов: Исследование профинансировано в рамках стипендии Thomas Addison Scholarship при St Georges Hospital Trust. Авторы не сообщают о конфликте интересов и не имеют дополнительных сведений для раскрытия.

Регистрационный номер исследования: Не применимо.